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含有Cys的多肽在出貨前經過還原了嗎?
如果沒有發現肽已經被氧化,我們一般不對Cys 進行還原。所有的多肽都是由粗品在pH2條件下純化、凍干后得到的,這樣的pH條件至少在某種程度上防止了Cys的氧化。含Cys的肽一般在pH2條件下進行純化,除非有特殊原因需要在pH6.8條件下純化。如果純化在pH6.8進行,純化產物必須馬上用酸處理以防氧化。在最后的質量控制環節,對于含有Cys的肽,如果MS 圖譜上發現有分子量為(2P+H)的物質存在,說明已形成二聚體。如果MS和HPLC都沒有問題,我們就直接凍干后出貨,無須再做任何處理。需要指明的是,含有Cys的肽隨著時間的推移會發生緩慢的氧化,氧化程度主要取決于肽序列及貯存條件。
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如何確定肽已成環?
我們用Ellman反應來檢測成環反應是否完全。如果Ellman檢測結果為陽性(黃色),說明成環反應不完全;如果檢測結果為陰性(不是黃色),說明成環反應已進行完全。我們對客戶不提供環化鑒定的分析報告,一般在QC報告單中會有關于Ellman檢測結果的描述。
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我需要合一條環肽,其中含有一個色氨酸,它會被氧化嗎?
色氨酸的氧化是肽氧化中的常見現象,而肽一般是先環化再純化,如果其中的色氨酸發生了氧化作用,肽在HPLC柱上的滯留時間會發生變化,氧化可以通過純化去除。再者,氧化的肽也可以通過MS檢測到。
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是不是在肽和修飾標記的染料之間都需要加一個間隔?
如果你打算將一個大分子(如某種染料)連到肽上,最好在肽和配體之間設一個間隔,以盡量減少肽本身的折疊作用或者其偶聯物的折疊作用對受體造成的干擾。也有人不希望間隔的存在,例如,在蛋白質的折疊研究中,可以通過確定將熒光染料連在某個氨基酸的某個位點上來研究二者在折疊結構上相距多遠。
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如果想在N端做生物素修飾,需要在生物素和肽序列之間加一個間隔嗎?
我公司采用的標準的生物素標記程序是先往肽鏈上連一個Ahx,然后再連生物素。Ahx是一個6碳化合物,把它加在肽和生物素之間起到間隔的作用。
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就磷酸化肽的設計能不能給出一些建議?
隨著長度的增加,從磷酸化的那個氨基酸往后偶聯效率逐漸降低。合成方向從C端到N端,建議磷酸化的那個氨基酸以后的殘基不要超過10 個,也就是說從N端往C端數磷酸化氨基酸之前的氨基酸殘基最好不要超過10個。
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為什么要進行N端乙?;?,C端酰胺化修飾?
這些修飾可以使肽不會被降解掉,也可以使肽模擬它在母本蛋白中α氨基和羧基的原始狀態。